Gene Targeting 전략:

바이오사이토젠의 전문적인 기술팀과 영업팀은 고객님이 필요로 하는 동물 모델의 제작에 도움을 드리기 위하여 노력하고 있습니다.

고객 맞춤형 모델을 만들기 위하여 우리는 다음과 같은 전략을 사용합니다:

· Global Knockout

· Conditional Knockout

· Global Knockin

· Conditional Knockin

· Cre (ERT2) Knockin

· Point Mutation Knockin

· Tag and Reporter Gene Knockin

· Rosa26 Locus Knockin

· Tol2 Transgenic

주의: ESC/HR 기술과는 달리, CRISPR 기반 EGE™ 기술을 사용하여 동물 모델을 제작할 때는 유전자 타겟팅을 위한 특정 마커가 일반적으로는 필요하지 않습니다. 아래에 나열된 전략은 기존의 ESC/HR 기술에 기반한 것 입니다.


Global Knockout

Global knockout (KO) 모델에서는 목표로 하는 유전자가 전신에서 삭제되거나 (EGE™ method를 사용했을 경우), positive selection marker (일반적으로 Neomycin을 사용)로 대체되어 (ESC/HR의 경우), 유전자를 불활성화시킵니다. 전신 KO 마우스에서는 모든 조직에서 목표 유전자가 불활성화됩니다.  

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Conditional Knockout

Conditional Knockout (cKO) 모델은 Cre-LoxP나 Flp-Frt 재조합 시스템을 사용하여 제작됩니다. knock out되어야 할 목표 지점 양 옆으로 LoxP (혹은 Frt) 요소가 삽입됩니다. 이 마우스들은, 조직 특이적 Cre 혹은 Flp 마우스와 교배되게 되고, 그 결과로 태어나는 마우스의 특정 조직의 게놈에서만 양쪽 LoxP 사이의 서열이 제거됩니다. LoxP는 일반적으로 ATG가 있는 엑손의 하위 인트론에 삽입되게 되며, 사이에 끼인 엑손의 제거는 단백질 발현을 막는frame-shift의 결과로서 나타나게 됩니다. 

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Global Knockin

Global knockin 마우스 모델은 마우스 게놈의 특정 위치에 변이되거나 외부의 DNA 서열을 도입한 것 입니다. 이러한 모델들은 변이된 유전자가 도입되어 유전질환을 재현하는데 사용되거나, 유전자에 EGFP, mRFP, mCherry, YFP, LacZ, Flag과 같은 다양한 단백질을 표지하여 유전자 발현을 모니터링하는데 사용될 수 있습니다.

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Conditional Knockin

 Conditional knockin 마우스 모델에서는, LoxP (혹은 Frt) 요소가 삽입된 마우스들이 Cre 마우스들과 교배되어, 특정 조직에서 외부 유전자의 발현을 가능하게 합니다.

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Cre (ERT2) Inducible Mouse Model

Cre 재조합 단백질은 loxP 사이의 DNA 영역을 특정 조직에서 삭제하는 역할을 합니다. 그러므로, Cre 마우스 모델에서는 Cre를 발현시키는 프로모터에 따라서 특정 조직에서의 유전자를 knockout 시킬 수 있습니다. ERT2는 estrogen receptor targeting motif의 약자로서, 타목시펜에 의하여 핵으로의 전이 및 활성이 조절됩니다. 즉, 타목시펜을 주입했을 때 Cre 활성이 일시적으로 기능하거나 유도될 수 있어서 선택적인 유전자 삭제를 가능하게 합니다.

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Point Mutation Knockin

Conventional Point Mutation

Conventional point mutation는 마우스 게놈에서 하나 혹은 그 이상의 뉴클레오타이드가 다른 뉴클레오타이드들로 대체된 knockin 마우스 입니다. 이는 영역 내에서의 단백질 서열 중 아미노산의 변경이나 frameshift 변이의 결과로 나타납니다. Point mutation knockin 마우스 모델은 단백질 내의 특정 뉴클레오타이드나 아미노산의 역할을 연구할 때나, 인간의 유전 질병 모델로서 널리 이용됩니다.

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Conditional Point Mutation

Conditional point mutation mouse는 특정 조건을 충족하였을 때, point mutation이 이루어지는 마우스 모델입니다. 이 전략 하에서는, Cre재조합효소가 존재할 때, Cre 활성을 통하여 마우스의 특정 조직의 게놈에서 point mutation이 일어납니다. 이와 관련된 두가지 주요 디자인이 아래 그림으로 표현되어 있습니다. 

Conditional Point KI by Double LoxP (Flex)

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Conditional Point KI by Minigene

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Tag and Reporter Gene Knockin

EGFP, YFP, LacZ, Flag, mCherry 등의 서열로 표지된 유전자들은 유전자의 발현을 모니터링하기 매우 유용합니다. 리포터 유전자 마우스 모델은 세포 연구 개발에 있어서 계통수 제작에 주로 사용됩니다. 내재된 유전자를 리포터 유전자로 교체하는 것은 그 마우스 모델 내에서 유전자의knockout, knockin을 이끌 수 있습니다.

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Rosa26 Locus Knockin

기존의 트랜스제닉 마우스 모델들은 플라스미드를 핵에 직접 주입하여 제작되었기 때문에, 서로 다른 모델들이 얻어지는 경우가 많았습니다. 복제된 숫자와 위치 모두 제각각이었기 때문에 이렇게 각기 다른 마우스로부터 얻어지는 실험 결과들도 엉망이었고 재현되기 힘들었습니다. 현재 연구자들은, 유전자 편집 마우스를 제작할 때 특정 영역 도입전략을 사용하고 있습니다. Rosa26는 가장 많이 이용되는 검증된 안전한 영역으로서, Rosa26는 거의 모든 조직 내의 핵에서 RNA가 발현할 때 필수적이지 않은 영역이기 때문입니다. 외부 유전자의 조건부적 발현은 LoxP-3XSTOP-LoxP 서열과 외부 유전자 서열이 Rosa26에 삽입된 후 Cre 마우스와 교배되었을 때 일어납니다. 이 외에도 H11, TIGRE 등 여타 검증된 안전 영역이 있습니다.

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Tol2 Transgenic

Tol2 마우스 모델은 Tol2 transposase의 활성을 이용하여 제작되는 트랜스제닉 마우스입니다. Tol2 transposon 시스템은 유전자의 도입률을 증가시킬뿐만 아니라, A/T가 풍부한 영역에서 외부 유전자를 더 잘 도입하는 경향이 있습니다.

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