CRISPR 플라스미드 제작

CRISPR/Cas9 기술을 통한 성공적인 유전자 편집을 위하여 가장 중요한 단계 중 하나는 targeting의 특정성을 결정하는 sgRNA 를 잘 디자인하고 제작하는 것 입니다. 우리의 기술팀은 sgRNA 를 디자인하고 검증하는데 많은 신경을 씁니다. 오직 높은 특정성과 활성을 지닌 sgRNA 들만 선택하여 다음 단계를 진행하게 됩니다.

서비스 개요

sgRNA Targeting SpeciessgRNA PromoterPlasmid Screening MarkersbDeliverablesDelivery CriteriacOptional ServicesdDelivery Time
Rat, Mouse, Human, Primate, Other Mammals. aU6

T7

PuroR

mCherry

Plasmid

Sequencing file

Quality report

Total amount > 5 μg

Concentration > 50 ng/μL

Enzyme digestion validation

Sanger sequencing

sgRNA efficiency determination10 business days

a. 마우스, 랫트 이외의 종에서의 유전자 편집은 미리 문의해주세요.

b. 고객 요청에 따라 형광 리포터 유전자나 기타 저항성 유전자를 도입할 수 있으니, 언제든 문의바랍니다.

c. 고객 요청에 따라 플라스미드의 양이 조절 가능합니다. Endotoxin-free maxiprep 플라스미드도 제공 가능합니다.

d. 우리는 서비스 메뉴얼에 따라서, in vitro sgRNA 분석 서비스를 제공합니다.

서비스 과정

sgRNA targeting 유전자 확인

sgRNA 디자인 후 고객님에게 보내 확인

플라스미드 제작 및 확인

플라스미드 삽입 후 결과 보고

CRISPR 활성 분석

우리의 플라스미드 제작 서비스에서는 in silico 방식으로 sgRNA를 디자인한 후, 높은 활성의 sgRNA를 빠르고 정확하게 선별하는 단계가 필수적입니다. 우리는 이를 위하여 in vitro에서 sgRNA의 활성을 빠르게 분석할 수 있는 간편하면서도 민감도가 높은 UCA method를 개발하였습니다. UCA 분석법은 또한 호환성이 높으며, SSA (Single Strand Annealing) 에 기반한 메카니즘입니다. [1] (Figure 1)

技术-UCA方法Figure 1. SSA 메카니즘을 사용하여 CRISPR/Cas9의 활성을 측정하는 모식도

CRISPR/Cas9 eukaryotic expression 플라스미드와 (expressing Cas9 and sgRNA) pUCA 플라스미드를 동시에 세포에 전이시킨 후에, Cas9-sgRNA 복합체는 pUCA 플라스미드상의 sgRNA에 해당하는 목표 지점에 결합하여 절단할 것 입니다. 이에 SSA의 DNA 수복 메카니즘이 시작되게 되고, 루시퍼라아제의 homologous complementary 서열이 루시퍼라아제의 완전한 코딩 서열을 형성하게 되어, 이 유전자가 발현되게 됩니다. 그리하여 루시퍼라아제 활성으로 sgRNA 활성을 분석할 수 있고, 더 높은 루시퍼라아제 활성은 더 높은 sgRNA 활성을 나타냅니다.

많은 sgRNA 디자인 도구들이 sgRNA의 활성을 예측할 수 있다고 선전하고 있지만, 예측된 결과와 실제 활성 사이에는 큰 차이가 있습니다. 그러므로 실험 결과의 성공률을 높이기 위하여 sgRNA의 활성을 실험적으로 직접 검증하는 것이 필수적입니다. 

우리의 데이터는 UCA method가 sgRNA의 in vivo 활성을 정확히 예측할 수 있다는 것을 보여주고 있으며, 이는 저명한 학술지에 인용됨으로서 증명된 바 있습니다.  [2,3]. 요약하자면, sgRNA의 높은 활성을 검증하는 바이오사이토젠의 UCA 시스템은 CRISPR/Cas9 유전자 편집 성공의 열쇠입니다.

서비스 장점

1. 높은 효율과 빠른 속도 : 2주만에 sgRNA를 제작하여 활성 테스트까지 끝낼 수 있습니다.

2. in vivo 활성과 근접한 고감도의 정확한 테스트

3. 종 제한 없음

[1]. Mashiko, D, et al. “Feasibility for large-scale mouse mutagenesis by injecting CRISPR/Cas plasmid into zygotes. ” Development Growth & Differentiation 56.1(2014):122.

[2]. Wu M, Wei C, Lian Z, et al. Rosa26-targeted sheep gene knock-in via CRISPR-Cas9 system[J]. Scientific reports, 2016, 6.

[3]. Lin, Zhimiao, et al. “Stabilizing mutations of KLHL24 ubiquitin ligase cause loss of keratin 14 and human skin fragility.” Nature Genetics 48.12 (2016): 1508-1516.

Donor Plasmid 제작

바이오사이토젠은 수천가지의 마우스, 랫트, 세포주를 10여년간 개발해왔습니다. 우리의 빠른 플라스미드 디자인 및 제작 서비스는 targeting vectors (ESC/EGETM-based gene editing) 와 transgenic vectors (Tol2 transgenesis)를 제작하는데 적합합니다.

서비스 개요

SpeciesaDeliverablesDelivery CriteriaOptional Services
 Rat

Mouse

Cell line

 Plasmid

Sequencing file

Quality report

 Total amount > 5 μg

Concentration > 50 ng/μL

Enzyme digestion validation

Sanger sequencing

Endotoxin-free maxiprep plasmid

Pronucleus injection plasmid preparation

서비스 절차

1. 목표로 하는 유전자를 확인한 후, 유전자 편집 전략을 디자인하고 확인합니다;

2. 플라스미드 서열을 디자인한 후 고객님께 확인을 받습니다;

3. 플라스미드를 제작합니다;

4. 플라스미드를 발송합니다.

Back to top
카카오톡 상담하기