RenNano® 마우스의 주요 특징
1. 완전 인간형 중쇄 가변 영역과 수정된 상수 영역
2. RenNano 마우스는 여러 항원에 대해 강력한 면역 반응을 보입니다
RenNano 마우스의 TFR1, 4-1BB, ALB에 대한 면역 반응. TFR-1과 4-1BB(막 항원)으로 면역한 RenNano 마우스의 혈청은 희석되어 항원 발현 CHO 세포와 인큐베이션되었습니다. 형광 표지된 2차 항체를 사용하여 CHO에 결합한 HCAb를 라벨링하고, 흐름 세포 분석을 통해 평균 형광 강도(MFI)를 측정하여 항원 특이적 HCAb의 titre를 나타냈습니다. ALB(분비 항원)로 면역한 RenNano 마우스의 혈청은 희석되어 형광 표지된 2차 항체와 인큐베이션되었습니다. ELISA를 사용하여 OD450을 측정하여 항원 특이적 HCAb의 titre를 나타냈습니다.
3. RenNano 유래 항원 특이적 HCAb는 뛰어난 다양성을 보입니다
RenNano 마우스 유래 HCAb는 다양하며, 많은 수가 긴 CDR3 영역을 포함합니다. 항원 특이적 HCAb는 그들의 중쇄 종계 유전자 사용과 CDR3 길이에 따라 분석되었습니다. 분석 결과는 광범위한 IGHV 종계 다양성을 보여줍니다. 또한, 관찰된 대부분의 CDR3 길이는 12개 아미노산을 넘었으며, 일부는 17개 아미노산 이상이었습니다.
RenNano® 마우스의 검증 데이터
68개의 정제된 RenNano HCAb의 8개 타겟(4-1BB, TROP2, IL3RA, OX40, Nectin-4, ROR1, PSMA, DLL3)에 대한 친화도는 SPR로 테스트되었습니다. 대부분의 HCAb에서 KD는 10-6 ~ 10-10 M 범위였습니다.
RenNano 마우스의 B세포 발달 및 분화 패턴. RenNano 마우스는 외부 림프기관(비장, SP, 림프절, LN)에서 B세포 비율이 야생형 마우스 또는 RenMab 마우스와 비교하여 비슷합니다. RenNano 마우스의 비장에는 야생형 마우스나 RenMab 마우스와 비교하여 여포 B세포(FO-B)와 가장자리지대 B세포(MZ-B) 비율이 비슷합니다.
RenNano HCAb의 물리화학적 특성 분석. RenNano HCAb는 한 번의 정제 후 높은 순도를 보였습니다(A). HCAb는 HIC-HPLC 및 CIC-HPLC에서 짧은 유지 시간을 보여주며, 이는 뛰어난 친수성과 특이성을 나타냅니다(B, C). RenNano HCAb는 또한 우수한 열 안정성을 보였습니다(D).
차세대 RenNano® 마우스:
완전 인간 유래와 FR2 낙타화(FERF) 인간 V 유전자를 결합하여 VHH 발견 잠재력 극대화
인간 중쇄 단일 항체(HCAb) 발견을 위한 당사의 독점 RenNano® 마우스 플랫폼을 기반으로, 차세대 RenNano® 마우스는 원래의 완전한 인간 V 유전자 레퍼토리를 유지하면서 수십 개의 엔지니어링된 프레임워크 영역 2(FR2) 낙타화 인간 V 유전자 세그먼트
를 통합합니다.
이 확장된 레퍼토리는 발견 성공률을 극대화하고 구조적 에피토프 커버리지를 넓히도록 설계되었습니다.
FR2 엔지니어링: 스크리닝 성공률과 개발 가능성 향상
인간 중쇄에서 37, 44, 45, 47번 위치(Martin 넘버링 체계)의 FR2 잔기는 VH-VL 계면의 일부를 형성합니다. 이 잔기들은 일반적으로 소수성이며 VGLW(Val-Gly-Leu-Trp) 모티프로 대표되며, 통상적으로 기존 이종사량체 항체 내부에 매립되어 있습니다.(Sang 외, 2022, Structure)
그러나 중쇄 단독 또는 VHH 형태에서는 이러한 위치가 더 용매에 노출됩니다. 따라서 자연 발생 낙타과 중쇄 단독 항체는 이러한 위치에 더 친수성 잔기를 가지며, 가장 두드러진 것은 특징적인 FERF
(Phe-Glu-Arg-Phe) 모티프입니다.(Sang 외, 2022, Structure)
노출된 소수성 잔기를 더 친수성 잔기로 대체함으로써, FR2 낙타화는 불필요한 소수성 상호작용을 줄여 응집을 완화하고 후보 물질의 전반적인 개발 가능성을 향상시킵니다.
비교 연구에 따르면 FERF 모티프를 통합한 인간화 라이브러리는 인간 VGLW 모티프 기반 라이브러리보다 생존 가능한 리드 후보를 분리하는 데 더 높은 스크리닝 성공률을 달성할 수 있습니다.(Arras 외, 2023, mAbs)
당사의 사내 데이터는 또한 낙타 FR2 시그니처를 유지하는 임상 단계 VHH가 인간 VGLW 모티프를 가진 VHH보다 더 높은 발현 수율과 더 큰 열 안정성을 보인다는 것을 보여줍니다.
차세대 RenNano®의 전략적 장점
- 응집 위험 감소 및 개발 가능성 향상:
더 친수성인 FERF 프레임워크는 불필요한 소수성 상호작용과 응집 위험을 줄이는 데 도움을 주어, 용해도 향상, 비특이적 결합 감소, 전반적인 개발 가능성 개선, 리드 발굴 성공률 향상을 지원합니다.
- 듀얼 엔진 서열 다양성:
완전한 인간 V 유전자(VGLW)와 엔지니어링된 FR2 낙타화 인간 V 유전자(FERF)를 결합하여, 표적화하기 어려운 에피토프에 걸친 후보 다양성을 확장합니다.
- 완전 인간 유래 잠재력 유지:
원래의 인간 V 유전자 레퍼토리를 유지하여, 수정되지 않은 인간 서열이 선호되는 경우 발견 캠페인이 완전 인간 VHH를 계속 생성할 수 있게 합니다.
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생체 내
친화도 성숙:
자연적인 생체 내
친화도 성숙을 가능하게 하여 고친화도 VHH 리드를 생성하고, 하류 최적화를 간소화합니다.
FR2 낙타화는 대장균
에서 가용성 VHH 발현을 향상시킵니다
FR2 낙타화는 대장균
에서 가용성 VHH 발현을 크게 향상시켜 100% 발현 성공률과 현저히 높은 발현 수율을 달성합니다.
RenNano® 마우스에서 유래한 VHH는 대장균에서 발현되었고 사내에서 정제되었습니다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시됩니다.
FR2 낙타화 인간 VHH-Fc는 현저히 향상된 친수성을 나타냅니다
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 분석은 FR2 낙타화 VHH-Fc가 현저히 더 짧은 체류 시간을 나타내어, 표면 친수성의 뚜렷한 향상과 더 유리한 용해도 프로파일을 보여줍니다. RenNano® 유래 VHH-Fc는 CHO 세포에서 발현되었고 사내에서 정제되었습니다. 데이터는 중앙값과 사분위수 범위로 표시됩니다.
FR2 낙타화 VHH는 현저히 개선된 단량체 순도를 나타냅니다
FR2 낙타화 VHH는 개선된 단량체 순도를 보여주며, 엄격한 순도 기준(>80%, >90%, >95%)을 충족하는 클론의 비율이 현저히 높습니다. RenNano® 유래 VHH는 CHO 세포 또는 효모에서 발현되었고 사내에서 정제되었습니다. 11개의 완전 인간 VHH는 모두 효모에서 발현되었고, 60개의 FR2 낙타화 VHH 중 10개는 효모에서, 50개는 CHO 세포에서 발현되었습니다.
