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Biocytogen의 전문 기술팀 및 영업팀은 연구자가 필요한 동물 모델을 실현하는 데 도움을 주고 있습니다. 우리의 맞춤형 모델에 사용되는 유전자 타겟팅 전략은 다음과 같습니다:
전신 녹아웃 (KO) 마우스 모델에서는 목표 유전자의 엑손이 전신에서 삭제(EGE™ 방법)되거나 양성 선택 마커(대부분 네오마이신)로 교체되어 유전자가 비활성화됩니다. 전신 녹아웃 마우스에서는 목표 유전자가 모든 조직에서 파괴됩니다.
전신 녹인 마우스 모델은 특정 유전자좌에 돌연변이 또는 외래 DNA 서열을 도입합니다. 이러한 모델은 유전자 돌연변이가 유발하는 유전 질환을 모방하거나, 유전자와 다양한 단백질 태그(예: EGFP, mRFP, mCherry, YFP, LacZ, Flag)가 결합되어 있을 때 유전자 발현을 모니터링하는 데 사용됩니다.
조건부 넉아웃(cKO) 모델은 Cre-LoxP/Flp-Frt 재조합 시스템을 통해 생성됩니다. 넉아웃 대상이 되는 표적 단편은 LoxP(또는 Frt) 엘리먼트에 의해 양쪽이 둘러싸여 있습니다. 이어서 플록스드 마우스(floxed mice)를 조직 특이적 Cre 마우스 또는 Flp 마우스와 교배시킴으로써, 자손의 게놈에서 LoxP 부위 사이의 서열이 조직 특이적 패턴으로 제거됩니다. 일반적인 설계에서 Cre 마우스는 표적 조직에서만 재조합을 유도합니다. LoxP 단편은 일반적으로 ATG를 포함하는 엑손 하류의 인트론에 삽입되며, 양쪽이 둘러싸인 엑손이 제거되면 프레임 시프트(frame-shift)가 발생하여 단백질 발현이 파괴됩니다.
조건부 넉인(cKI) 마우스 모델은 플록스드 대립유전자(floxed allele)를 보유한 마우스를 조직 특이적 또는 유도성 Cre 마우스나 CreERT2 마우스와 교배시킴으로써, 점 돌연변이、리포터 유전자、기능적 카세트 등 외인성 유전자 요소의 조직 특이적 활성화를 가능하게 합니다. 이를 통해 Cre 리콤비나제가 존재하는 부위에서만 활성화가 이루어지도록 보장됩니다. 이러한 모델은 일반적으로 FLEx(Flip-Excision/dual-lox) 시스템 또는 미니진 기반 설계를 이용하여 생성되며, 이를 통해 조작된 돌연변이나 리포터 유전자가 공간적 및/또는 시간적으로 제어된 방식으로 발현될 수 있게 합니다. 이 Cre-lox 유도형 cKI 전략은 유전자 조절 연구、계통 추적(lineage tracing) 수행、세포 유형 특이적 생물학적 기능 해석에 널리 활용됩니다.
전통적인 점 돌연변이 마우스 모델은 마우스 유전체에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 변이된 뉴클레오타이드로 대체되는 녹인 마우스 계통입니다. 이로 인해 특정 단백질 서열 내에서 동일한 프레임의 아미노산 변화가 일어나거나 프레임 이동 돌연변이가 발생할 수 있습니다. 점 돌연변이 녹인 마우스 모델은 특정 뉴클레오타이드 또는 아미노산이 단백질 내에서 어떻게 작용하는지 연구하는 데 널리 사용되며, 이는 인간 유전 질환 연구와 직접적으로 관련이 있습니다.
조건부 점 돌연변이 마우스 모델은 특정 조건이 충족되면 점 돌연변이를 도입합니다. 아래의 유전자 타겟팅 전략에서는 Cre 재조합 효소가 있을 때, 점 돌연변이가 조직 특이적으로 Cre 활성을 통해 도입됩니다. 아래에 두 가지 주요 설계 전략을 보여줍니다.
전통적인 트랜스제닉 마우스 모델은 원핵 주입법을 사용하여 질량 플라스미드를 생성하며, 여러 가지 창립 마우스를 얻을 수 있습니다. 창립 마우스들 간에 통합 복제 수와 유전자좌의 차이로 인해, 서로 다른 창립 마우스에서 실험 결과가 재현되지 않거나 다를 수 있습니다. 현재 대부분의 연구자들은 유전자 편집 마우스 모델을 구축할 때 위치 특이적 통합 전략을 사용합니다. Rosa26은 가장 일반적으로 사용되는 "안전한 장소" 유전자좌로, Rosa26은 거의 모든 조직에서 발현되는 비필수 핵 RNA를 암호화합니다. 외래 유전자가 Rosa26 유전자좌에 삽입되면, LoxP-3XSTOP-LoxP 서열이 외래 유전자 상류에 삽입되어 조건부로 외래 유전자가 발현됩니다. 이 모델은 Cre 제거 마우스와 교배됩니다. 다른 안전한 유전자좌로는 H11과 TIGRE가 있습니다.
EGFP, YFP, LacZ, Flag, mCherry 등으로 태그된 유전자는 유전자 발현을 모니터링하는 데 유용합니다. 보고 유전자 마우스 모델은 세포 발달 연구를 위한 계통수를 구축하는 데 사용됩니다. 내인성 유전자를 보고 유전자로 대체하면, 동일한 마우스 모델에서 유전자 녹아웃과 녹인을 동시에 구현할 수 있습니다.
Tol2 마우스 모델은 Tol2 트랜스포좀 효소의 활성을 이용해 트랜스제닉 마우스를 생성합니다. Tol2 트랜스포좀 시스템은 유전자 통합율을 높일 뿐만 아니라, 외래 유전자를 AT가 풍부한 영역에 통합하는 경향이 있습니다.
당사의 유전자 편집 서비스 작동 방식 Biocytogen은 생물정보학을 활용하여 sgRNA와 유사한 서열이 포함된 표적 유전체 영역을 검색함으로써 오프타겟 활동을 최소화합니다. 따라서 높은 특이성과 높은 활성을 가진 sgRNA만 선택됩니다. 품질 관리의 일환으로, 우리는 잠재적인 오프타겟 사이트 주변의 유전체 영역을 증폭하기 위해 두 번의 PCR을 수행하고, 이어서 시퀀싱을 통해 오프타겟 사건을 탐지할 수 있습니다. 또한, 랜덤 삽입 가능성을 탐지하기 위해 knock-in 및 조건적 knock-out 동물 모델 생성 워크플로우에 Southern blot을 통합하여 중요한 품질 관리 단계를 추가하였습니다. 프로젝트가 시작되면 전담 프로젝트 매니저가 배정되며, 매달 모델 진행 상황을 업데이트하고 언제든지 연락을 취할 수 있습니다.
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Flvc2GFP 대립유전자는 배아줄기세포에서 동종 재조합에 의해 생성되었습니다. 두 세트의 반전된 loxP 사이트(하나는 정상 세트, 다른 하나는 변형된 세트)가 도입되어 Cre 재조합 후 두 번째 엑손을 제거하고 eGFP를 프레임 내에서 반전시킵니다. 클론 구조의 검증은 Southern blot을 사용하여 두 개의 프로브와 두 개의 제한 효소를 이용하여 수행되었습니다.
